Revista El Dolor 59 | Julio 2013 - Año 23 | Originales

Efecto Subagudo de la Administración Subcutánea de Morfina en la Apoptosis Neuronal en Corteza Cerebral de Ratones Machos CF-1

Resumen

La prevalencia de dolor crónico moderado a severo es elevada, tanto en pacientes oncológicos como no oncológicos y la principal herramienta en su manejo es la administración de opioides, especialmente morfina. Este tratamiento es efectivo en el efecto analgésico, pero presenta toxicidad renal y hepática, entre otras. En trabajos previos se ha reportado que las sustancias producen efectos tóxicos en   el sistema donde actúan. Por lo tanto, es necesario estudiar sus efectos tóxicos a nivel del sistema nervioso central, especialmente  en  los  mecanismos  de   muerte   celular. En la presente investigación se estudia el efecto de una administración subaguda de morfina  por  vía  subcutánea en la apoptosis neuronal en la corteza cerebral de ratones machos CF-1. El diseño experimental incluyó 4 grupos experimentales: control negativo, control positivo (vehículo), grupo modelo dolor (inyección plantar de formalina) y grupo experimental (morfina 10% 0,6 ml c/6 horas por 48 horas). Luego de 48 horas se sacrificaron para extraer sus cerebros, los que fueron cortados, fijados y teñidos con técnica corriente (H&E), para analizar morfológicamente la muerte celular. Además, se realizó tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anticaspasa-3 para evidenciar la  apoptosis como mecanismo de muerte celular. En los cortes se contaron el número de células muertas del total de células en un área determinada, para obtener el porcentaje de células apoptóticas en  cada grupo. Los resultados indican  la presencia de una diferencia significativa en  los niveles de apoptosis del grupo experimental en comparación con el grupo control negativo, sin embargo, la diferencia es mayor entre el grupo modelo dolor versus grupo experimental tanto como con el grupo control negativo. Las células muertas fueron positivas a la tinción inmunohistoquímica con anticaspasa 3. Los resultados sugieren la existencia de un efecto neurotóxico vía apoptosis en la  corteza cerebral de la morfina que, sin embargo, es menor que el producido por el dolor en el grupo con un modelo de dolor, lo que confirmaría el beneficio de la terapia analgésica activa. Esto nos permite conocer nuevos mecanismos de toxicidad y teóricamente, permitir desarrollar terapias más seguras y efectivas a largo plazo.
Palabras clave: Morfina, apoptosis, corteza cerebral.
 

Abstract

The prevalence of moderate to severe chronical  pain  is high in the oncologic and no oncologic patient, and  the  gold standard of treatment for the  pain  management  is the administration of opiods, especially morphine. This treatment is effective in  the  analgesic  effect, but  it  has  a renal and hepatic toxicity, among others. In previous papers it has been reported that the substances have produced toxicity in the systems where they produce their effect. Therefore it  is  necessary to  study its toxic effect   at a central nervous system, especially its cell death mechanism. In the present investigation  it  was  studies  the effect of subaccute administration of subcutaneous morphine in the neuronal apoptosis in the brain cortex of male CF-1 mice. For this purpose 4 experimental groups were used: negative control, positive control (vehicle), pain model group and the experimental group (morphine 10% 0,6 ml every/6 hours per 48 hours). After 48 hours they were euthanasied in order to remove their brains and then they were sliced, which were fixed and stained with routine technique (H&E), to morphologically analize the cell death. Besides, it was performance immunochemistry stained with anticasapasa 3 antibodies to demonstrate the cell death mechanism via apoptosis. In the slices it was counted the number of death cells from a total of cells in a determinated area, for obtaining the percent of apoptotic cells in each groups. Results indicate the presence of a significative difference in the apoptosis level from the experimental group, in comparison with negative control group, however the difference is greater in the pain model group versus experimental group and even greater versus negative control group. Dead cells were positive in anticaspasa 3 antibody stain. Results suggest the existence of a neurotoxic effect via apoptosis in the cerebral cortex of the morphine, nevertheless is significantly fewer in comparison with pain group, which would confirm the benefits of active analgesic therapy. It allows to know new toxicity mechanism and theoretically it would permit develop a safer and effective long term therapies.
Key words: Morphine, apoptosis, cerebral cortex.
 

Introducción

Los fármacos opioides son indispensables en el manejo de dolor tanto  agudo  como  crónico,  de  intensidad  moderada  a severa, en numerosas patologías. Sin embargo, se ha evidenciado en clínica que su uso repetido en el tiempo puede llevar al desarrollo de fenómenos de tolerancia analgésica. Los mecanismos neurobiológicos subyacentes al desarrollo de la tolerancia a los opioides son multifacéticos y solo parcialmente conocidos. Los primeros estudios respecto al tema han indicado que la apoptosis neuronal en algunas regiones del asta dorsal de la médula espinal estaría relacionada con la tolerancia a la analgesia opioide (1).
Los principales estudios biomoleculares relacionados con el desarrollo de tolerancia han mostrado que el receptor NMDA, un subgrupo de receptores de glutamato, estarían relacionados con el desarrollo de tolerancia a opioides, en especial con tolerancia relacionada con el receptor mu de opioides (2, 3) y esto estaría en directa relación con la prolongación en el tiempo de la administración de morfina (4,5).
Además, existiría una interrelación entre los mecanismos celulares responsables de la tolerancia a opioides y el dolor neuropático, sugiriendo que un mecanismo común podría estar envuelto en el desarrollo de ambos fenómenos (6). La activación de los receptores NMDA podrían responder a este mecanismo común, ya que existe evidencia que demostraría que el daño de nervios periféricos activaría los receptores NMDA a nivel de médula espinal, resultando en un severo y refractario dolor neuropático, secundario a activación de procesos de apoptosis neuronal (7).
La apoptosis es un mecanismo genéticamente determinado de muerte celular programada, que se puede activar por una serie de estímulos internos o externos. Los estudios de los complejos mecanismos moleculares y bioquímicos relacionados con la apoptosis han revelado que esta vía de muerte celular requiere de la activación secuencial de una cascada de cisteína-proteasas intracelulares, denominadas caspasas (8). De las más de 12 caspasas identificadas en humanos, la caspasa 3 juega un rol central en la concreción del fenómeno apoptótico (9).
Algunos estudios iniciales demostraron que los opioides inducían apoptosis en células neuronales in vitro expuestas a agonistas de receptores mu y kappa de opioides en cultivos neuronales (10) y en líneas celulares específicas, aumentando su vulnerabilidad a morir por mecanismos apoptóticos (11, 12, 13, 14, 15). Estudios posteriores relacionarían el fenómeno apoptótico con la inducción de tolerancia a opioides desde un punto de vista funcional (1, 16). Otros estudios han demostrado que el tratamiento crónico en ratas con morfina (tolerantes y dependientes) está asociado con modulación diferencial  de dos proteínas cerebrales claves en la regulación de la muerte celular programada a nivel neuronal, el receptor del ligando Fas (Fas receptor) con efecto proapoptótico, así como de BCL- 2, una oncoproteína de efecto antiapoptótico (17, 18). En forma complementaria, se ha demostrado que in vivo ocurre apoptosis neuronal en médula espinal y núcleo dorsal del rafe, luego de tratamientos crónicos con morfina (16, 19).
Los estudios que evalúan los mecanismos de toxicidad inducida por morfina centran la atención sobre los efectos de tolerancia a opioides, sin embargo, no hay comparación con los mismos fenómenos tóxicos inducidos por el dolor, en cuanto a la activación de los mecanismos de muerte celular programada. La presente investigación  intenta  evaluar  los  efectos  de  una administración subaguda de morfina a nivel de corteza cerebral de ratones, en comparación con los mismos efectos inducido por la presencia dolor, a través de un modelo animal de dolor agudo, observando la presencia de muerte neuronal morfológicamente, y mediante técnica inmunohistoquímica evidenciar la presencia de apoptosis, evaluando si existen diferencias entre los efectos del opioide y del dolor sobre las neuronas corticales.
 
 

Materiales y Métodos

Animales
Se utilizaron 16  ratones  machos  cepa  CF-1,  de  3  meses  de edad (20-30 g), provenientes del Bioterio Central de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile, mantenidos bajo condiciones estándar de bioterio, con comida y agua ad- libitum, cuyo manejo fue aprobado por el Comité de Ética para Investigación con Animales de la misma institución.
Reactivos y Fármacos
Se utilizó para el grupo experimental morfina clorhidrato 10% (Biosano®), diluida en solución fisiológica 0,9% (Fresenius Kabi®). La misma solución fisiológica fue utilizada como control positivo (vehículo). Para el modelo de dolor se utilizó formaldehído 4% (formalina 10%), tamponada pH 6,9 para uso en histología. Para la sedación de los ratones se utilizó ketamina (Biosano®). Los reactivos para técnicas de rutina (hematoxilina-eosina) fueron obtenidos  con  un  alto  grado  de pureza de distintas fuentes comerciales. Para la técnica inmunohistoquímica se utilizó anticuerpo anti-caspasa 3 (CPP32, LabVision™), según instrucciones de uso del kit por el fabricante.
Diseño experimental
Los 16 ratones fueron distribuidos en cuatro grupos: 1) Control negativo: no se les administró sustancia alguna. 2) Control positivo: se aplicó 0,1 ml de solución fisiológica 0,9% cada    6 horas por 48 horas en base de la cola, mediante inyección subcutánea. 3) Grupo modelo dolor: se aplicó una inyección intraplantar en extremidad inferior izquierda de 0,1 ml de formalina 10% por una vez. 4). Grupo morfina: se aplicó 0,1 ml de morfina 10% diluida en solución fisiológica 0,9% llevada a una concentración del 1%, en dosis de 5 mg/kg, cada 6 horas por 48 horas (dosis terapéutica en ratones 5 mg/kg SC) en base de la cola, mediante inyección subcutánea.
Los ratones fueron anestesiados mediante una dosis de ketamina al 5% (150 mg/kg vía intramuscular) y sacrificados mediante dislocación cervical. Todos los grupos fueron sacrificados a las 48 horas de mantenerlos en las mismas condiciones de Bioterio. Los encéfalos fueron removidos y fijados en una solución de formalina 10%, en buffer fosfato (pH 7,2) por 12 días y luego impregnados en parafina. Se obtuvieron cortes coronales seriados de 5 micrones, que fueron teñidos con hematoxilina- eosina. Los cortes obtenidos se estudiaron, identificando el área correspondiente a la corteza cerebral somatosensorial, según Atlas de Paxinos & Watson (20). Para la técnica inmunohistoquímica, los cortes fueron desparafinados y teñidos según las instrucciones del fabricante, con anticuerpo anti- caspasa 3. Los cortes fueron finalmente montados y evaluados con microscopio óptico con objetivo grillado, y se obtuvieron microfotografías de los mismos para su posterior análisis.
Conteo de neuronas y análisis de resultados
Se realizó el conteo de neuronas, considerando neuronas muertas o degeneradas aquéllas que presentaban marcada eosinofilia en soma y dendrita apical y retracción nuclear, con apariencia de grumos, según criterios en estudios previos (21, 22). Se realizaron 150 microfotografías de sendos cortes de cada hemisferio en la zona de la corteza somatosensorial, de cada uno de los ratones de los grupos estudiados. El conteo del número de neuronas vivas y muertas de cada microfotografía fue realizado en forma ciega por dos observadores independientes, registrando como valor final el promedio de la observación de cada una de las microfotografías, así como un promedio del porcentaje de neuronas muertas respecto al total de neuronas observadas, análisis que se realizó comparando capas superficiales y capas profundas de la corteza cerebral. La observación de la positividad a la tinción inmunohistoquímica se realizó y registró en forma cualitativa. Para cada grupo     se obtuvieron valores promedios y desviaciones estándares, siendo analizadas las diferencias estadísticas con Test de Kruskal-Wallis, con significancia de p<0,05.

Resultados

Análisis morfológico
Las Figuras 1 y 2 corresponden a microfotografías de la corteza somatosensorial de ratones del grupo control negativo y grupo morfina respectivamente. Se evidencian las características distintivas del tejido nervioso a la tinción con hematoxilina- eosina, destacando la presencia de neuronas con sus característicos nucléolos y citoplasma eosinófilo. Se muestra la localización de neuronas muertas, con su eosinofilia y cambios nucleares característicos. Se logra apreciar la diferencia en la cantidad de neuronas con características de muerte celular respecto al total de neuronas de cada corte.
Análisis inmunohistoquímico
La figura 3 muestra la tinción inmunohistoquímica que muestra la positividad a la presencia de caspasa 3 activada en el citoplasma neuronal, que destaca aquellas zonas donde esta enzima presenta su isoforma activada.
Porcentaje de neuronas muertas
El gráfico 1 muestra el porcentaje de neuronas muertas respecto al total de neuronas observadas en cada uno de los grupos experimentales.
Análisis estadístico
El primer análisis realizado permitió validar al grupo observador, evidenciando que no había diferencia significativa en los resultados obtenidos entre los observadores de cada uno de los cortes de los grupos experimentales. Además,  no  se  evidenció  diferencia entre los resultados obtenidos entre capas superficiales y profundas, por lo que para la evaluación se consideró el resultado de la corteza cerebral en su totalidad.
En cuanto a los grupos en estudio no se evidenció diferencia significativa entre el grupo control negativo y el control positivo (p=0,073), ni entre el grupo control positivo y el grupo morfina (p=0,438). En cambio, se evidenció mayor porcentaje de muerte neuronal en el grupo morfina respecto al grupo control negativo (p<0,005). En cuanto al  grupo  de modelo de dolor, el  porcentaje  de  muerte  neuronal  fue significativamente mayor a todos los otros grupos en estudio (p<0,005).

la cantidad de neuronas con características de muerte celular respecto al total de neuronas de cada corte.
Análisis inmunohistoquímico
La figura 3 muestra la tinción inmunohistoquímica que muestra la positividad a la presencia de caspasa 3 activada en el citoplasma neuronal, que destaca aquellas zonas donde esta enzima presenta su isoforma activada.
Porcentaje de neuronas muertas
El gráfico 1 muestra el porcentaje de neuronas muertas respecto al total de neuronas observadas en cada uno de los grupos experimentales.
Análisis estadístico
El primer análisis realizado permitió validar al grupo observador, evidenciando que no había diferencia significativa en los resultados obtenidos entre los observadores de cada uno de los cortes de los grupos experimentales. Además,  no  se  evidenció  diferencia entre los resultados obtenidos entre capas superficiales y profundas, por lo que para la evaluación se consideró el resultado de la corteza cerebral en su totalidad.
En cuanto a los grupos en estudio no se evidenció diferencia significativa entre el grupo control negativo y el control positivo (p=0,073), ni entre el grupo control positivo y el grupo morfina (p=0,438). En cambio, se evidenció mayor porcentaje de muerte neuronal en el grupo morfina respecto al grupo control negativo (p<0,005). En cuanto al  grupo  de modelo de dolor, el  porcentaje  de  muerte  neuronal  fue significativamente mayor a todos los otros grupos en estudio (p<0,005).
 

Grafico 1. Porcentaje de neuronas con morfología de muerte celular según grupo experimental. Se muestra los cuartiles 25 y 75 (caja), mediana (centro de caja)  y valores extremos (línea superior e inferior). (*) Diferencia significativa del porcentaje de neuronas muertas del grupo dolor respecto a los grupos morfina y controles (p<0,005). (**) Diferencia significativa del porcentaje de neuronas muertas del grupo morfina respecto al grupo control negativo (p<0,002).

Discusión

El presente estudio confirma  que  existe  una  influencia de los opioides sobre la sobrevida neuronal, induciendo aumento de la muerte neuronal, que al menos en parte estaría mediada por apoptosis. Sin embargo, demuestra que el efecto de un estímulo doloroso inducido en un modelo animal tiene un mayor efecto en esta sobrevida neuronal que el producido por la morfina. Incluso, si bien la diferencia no es significativa, se evidencia cierta tendencia para pensar que la administración del vehículo a través de inyección subcutánea tendría cierta influencia similar a la producida por el dolor.
Algunos estudios han demostrado la influencia que tiene la morfina sobre la modificación del equilibrio entre factores proapoptóticos y antiapoptóticos a favor de los primeros (17, 18), con lo que influiría en la activación final de los mecanismos de muerte celular programada. Además, otros estudios han sugerido que la morfina disminuye los niveles de HSP 70, proteína que protege a las células de la muerte celular/apoptosis en diferentes escenarios (23). Por otra parte, se ha propuesto que otras vías intracelulares podrían relacionarse con mecanismos activadores de apoptosis inducidos por morfina, incluyendo la inhibición de la oxido nítrico sintetasa (NOS) y la prevención de  la  activación  de las vías intracelulares calcio-dependientes (24, 25, 26, 27). Además, podría modularse el estrés oxidativo no sólo a nivel neuronal, sino también en células gliales (28, 29). Desde el punto de vista de las vías neuronales afectadas, estudios han demostrado que la administración de morfina en forma crónica ocasiona un aumento del tono gabaérgico y subsecuente disminución de la actividad serotoninérgica en sitios como el núcleo dorsal del rafe (30), y esta actividad disminuida participaría en la vía final que lleva  al desarrollo de tolerancia a opioides (31). También se ha comprobado que la mayor parte de las neuronas apoptóticas inducidas por morfina a nivel de médula espinal son neuronas gabaérgicas (1). Se postula que esto podría llevar a ocasionar  un  importante  grado  de  modulación de los circuitos involucrados en dolor y modulación del dolor, aumentando la sensibilidad al dolor por medio de desinhibición espinal, confirmado por los fenómenos de hiperalgesia inducida por opioides observado en animales (32, 33), así como en humanos (34, 35), lo que vería reforzado por el aumento de citoquinas proinflamatorias derivadas de las glias espinales, como IL-1b (36).
Los estudios han  concluido  que  la  apoptosis  neuronal  es parte del  desarrollo de  los  mecanismos de  tolerancia  a opioides, lo que implicaría mayor dificultad en su recuperación y mayor probabilidad de exacerbación con las subsecuentes terapias. Además, podría ocasionar cambios en las vías moduladoras del dolor, con cambios permanentes que llevan a fenómenos sensibilización secundarias, con escalada de dosis en forma creciente y desarrollo de dolor refractario. El conocimiento de los sitios de  modulación  de la tolerancia a opioides, tales como los receptores NMDA, entre otros, podría plantear eventuales objetivos terapéuticos para el control de la tolerancia a opioides.
Finalmente, el presente estudio permite evidenciar morfológicamente la presencia de un aumento del fenómeno de muerte neuronal en el grupo expuesto a morfina que, sin embargo, es superado por el grupo del modelo de dolor. Esto hace interesante plantear que el riesgo del desarrollo de toxicidad neuronal  por  morfina  es  compensado  por  el mayor efecto deletéreo que el propio dolor podría producir. El limitado número de los grupos experimentales y los tiempos breves que debieron realizarse para  adaptar el trabajo a los requerimientos de las disposiciones del Comité de Ética explica que no puedan obtenerse mayores conclusiones o inferencias de los resultados, sin embargo deja planteada la duda, y justifica una mayor investigación en profundidad de la ocurrencia del mecanismo de muerte neuronal mediada por apoptosis  inducida  por morfina, así como su  comparación con la producida por el dolor   y el lograr evidenciar el efecto de  la  analgesia adecuada en  distintas  áreas  cerebrales  y  a  distintos  intervalos   de tiempos, con modelos de administración crónica de opioides, por lo que  esta  investigación  inicial  entrega  las bases que respaldan y justifican la ampliación del diseño experimental, para hacerlo más homologable a las condiciones clínicas de pacientes expuestos a uso crónico de opioides.

 

Conflicto de Intereses

Autor(es) no declaran conflictos de interés en el presente trabajo.

Correspondencia:
Dr. Javier Quilodrán Peredo Unidad de Cuidados Paliativos, Hospital San Luis de Buin-Paine.
Unidad del Dolor y Cuidados Paliativos, Oncomed.
quiloper@hotmail.com